بخش تحقیقات گیاه پزشکی استان لرستان

کارایی روش های سرولوژیک برای تشخیص آلودگیهای ساده و مرکب ویروس های مهم سیب زمینی در سیستم تولید بذر

انواع مختلف سیب زمینی میزبان تعداد زیادی از ویروس ها هستند. حداقل 37 ویروس سیب زمینی زراعی را آلوده می کنند . آلودگی به برخی از این ویروس ها مانند ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی (Potato leafroll virus) و ویروسهای Y, S و A سیب زمینی ( به ترتیب Potato Virus Y, Potato Virus S و Potato Virus A) در سرتاسر جهان دیده می شود.. تهیه وکاشت بذور سالم موثرترین روش مدیریت بیماریهای ویروسی سیب زمینی محسوب می شود. تشخیص آسان، سریع و دقیق ویروس های گیاهی با استفاده از حداقل مواد گیاهی در تعداد نمونه زیاد، یکی از ارکان اصلی فرآیند تولید هسته های اولیه بذری عاری از ویروس و پیش نیاز اولیه در سیستم تولید بذر سالم سیب زمینی می باشد. چندین روش برای شناسایی ویروس ها وجود دارند. در این تحقیق دو روش الایزای ساندویچ دوطرفه آنتی بادی و الایزا بر روی غشای نیترو سلولزی برای تشخیص ویروس های مهم سیب زمینی از گیاهان مزرعه ای، گلخانه ای و درون شیشه ای مورد بررسی قرار گرفته است.

150 نمونه آلود ه جمع آوری شد و برای تعیین میزان آلودگی به ویروس های مهم سیب زمینی کشور شامل PVY, PVS, PVAو PLRV مورد آزمون قرار گرفتند . برای این کار از دو روش DAS-ELISA  و NCM-ELISA استفاده شد. آزمون DAS-ELSIA برای هر ویروس بر مبنای روش کلارک و آدامز انجام شد. هر آزمون شامل نمونه های گیاهی مورد آزمون به همراه شاهدهای مثبت هر چهار ویروس، شاهدهای منفی گیاه سالم و بافر PBS بود. پادتن و پادتن متصل به آنزیم آلکالین فسفاتاز ویژه PVY, PVS, PVAو PLRV به نسبت 1:300 به ترتیب در بافر پوششی (coating)، pH=9/6 و در بافر آنتی بادی نشان دار (conjugate) ، pH=7/4 ، مورد استفاده قرار گرفتند. در مرحله آخر نیتروفنیل فسفات به نسبت 1:1000 به بافر سوبسترا، pH=9/8 ، اضافه گردیده و استفاده شد. حد آلودگی طبق فرمول R=X + 2SD محاسبه شد. مراحل آزمون NCM-ELISA طبق روش مرکز بین المللی سیب زمینی انجام شد. از پادتن ویژه سروتیپ ها به نسبت 1:300 در بافر آنتی بادی و از پادتن ضد خرگوش نشاندار به نسبت 1:300 در بافر آنتی بادی نشان دار استفاده شد. برای رنگ آمیزی از محلول های نیتروبلوتترازولیوم در محلول 70% دای متیل فرمامید(Dimethylformamide nitro blue tetrazolium , DMF/NBT) و قرص 5- برومو-4-کلرو-3 ایندولیل فسفات، نمک تولوئیدن در محلول 100% دای متیل فرمامید (Toluidine salt of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, DMF/BCIP) استفاده شد. برای بررسی کارایی این دو روش در گیاهان درون شیشه ای از پنج نمونه گیاهچه سه هفته ای آلوده که بر روی محیط کشت MS رشد داده شده بودند استفاده شد.

بر اساس نتایج DAS-ELSIA از میان 150 نمونه مشکوک به آلودگی ویروسی سیب زمینی بیشترین نمونه آلوده (61 نمونه) مربوط به ویروس PVA بود و ویروس های PVS, PVY و PLRV ( به ترتیب با 56، 38 و 14 نمونه ) در درجات بعدی قرار داشتند. در مجموع از گیاهان مورد بررسی بر اساس آزمون DAS-ELISA  6/32%(49 مورد) به یک نوع ویروس ،  6/32%(49 مورد) به دو نوع ویروس، 4% (6 مورد) به سه نوع ویروس و 66/0 %( یک مورد) به 4 نوع ویروس آلودگی نشان دادند. در حالیکه 30%(45مورد) از این گیاهان، آلودگی به ویروسهای مورد بررسی نشان ندادند. بطور کلی 46% از گیاهان آلوده مورد بررسی دارای آلودگی ساده به یک ویروس و 54% آنها دارای آلودگیهای مرکب ویروسی بودند که 88% از آلودگیهای مرکب ، حاصل از دو نوع ویروس بود.

بر اساس آزمون NCM-ELISA از 150 نمونه مورد بررسی 8 نمونه به PLRV،  45 نمونه به PVY ، 59 نمونه به PVA  و 34نمونه به PVS آلوده بودند. در مجموع 51 مورد آلودگی حاصل از یک نوع ویروس ، 40 مورد آلودگی حاصل از دو نوع ویروس ، 5 مورد آلودگی حاصل از سه نوع ویروس بودند.

در تشخیص آلودگیهای ویروسی از بافتهای سبز گیاه، روش DAS-ELISA توانست تعداد نمونه آلوده بیشتری را در مقایسه با NCM-ELISA شناسایی کند و از این نظر دارای کارایی بیشتری بود. به دلیل  وجود محدودیت میزان بافت د رگیاهچه های درون شیشه ای ، امکان تشخیص ویروسها با مقادیر کم بافت گیاهی، با استفاده از روش NCM-ELISA مورد بررسی قرار گرفت . روش NCM-ELISA برای تشخیص ویروسها با استفاده از حداقل مواد گیاهی از گیاهان درون شیشه ای از کارایی خوبی برخوردار بود به طوریکه توانست ویروس PVY را در 05/0 گرم بافت گیاهی با رقت عصاره 1:10 شناسایی کند. این روش به ویژه برای تشخیص ویروسها از گیاهان درون شیشه ای که معمولاً کمتر از 1/0 گرم وزن دارند و در برداشت نمونه نبایستی به گیاه آسیب برسد مناسب می باشد در حالی که DAS-ELISA  این قابلیت را ندارد .این درحالی است که در مراحل گلخانه ای و مزرعه ای در سیستم تولید بذر سیب زمینی  که با تعداد نمونه گیاهی زیادی روبرو هستیم روش DAS-ELISA به علت حساسیت بالا و تکرار پذیر بود ن آن از یک طرف و عدم محدودیت بافت گیاهی از طرف دیگر روش بسیار ساده ، ارزان قیمت و کارآمدی می باشد.